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一種新型重組抗體導向溶栓劑的體外溶栓研究
發布時間:2017-06-09 ????文章來源:www.rjsfro.com??????? 點擊次數:417

  一種新型重組抗體導向溶栓劑的體外溶栓研究

  一種新型重組抗體導向溶栓劑的體外溶栓研究

  中國免疫學雜志 2000年第4期第16卷 分子與細胞免疫學

  作者:萬海英 劉征輝 顧津明 朱明清 李佩霞 阮長耿

  單位:萬海英(蘇州醫學院 附屬第一醫院江蘇省血液研究所血栓與止血研究室,蘇州 215006);劉征輝(蘇州醫學院 附屬第一醫院江蘇省血液研究所血栓與止血研究室,蘇州 215006);顧津明(蘇州醫學院 附屬第一醫院江蘇省血液研究所血栓與止血研究室,蘇州 215006);朱明清(蘇州醫學院重點實驗室,蘇州 215007)

  關鍵詞:活化血小板;單抗;單鏈尿激酶;基因表達;導向溶栓

  摘 要 目的:探討一種新型重組融合基因抗體導向溶栓劑SZ51Hu-scuPA的體外溶栓效力。方法:通過轉瓶擴大生產獲得的大量 基因重組融合蛋白SZ51Hu-scuPA,通過抗體競爭結合實驗確定融合蛋白的抗體親和力;進 而與尿激酶進行不同濃度血小板血漿凝塊體外溶栓比較。結果:該融合 蛋白體外纖溶活性為39 000 U/mg;其抗體親和力是鼠源性單抗的67%;體外溶栓效力較uPA 提高4.1~8.4倍。結論:體外溶栓結果證明,融合蛋白SZ51Hu-scuPA 既兼有與人活化血小板結合特性又有纖溶酶原激活劑特性的雙功能分子,是一種新型的抗體 導向溶栓劑。

  中國圖書分類號  R73-354

  Study on thrombolysis of a new recombinant ant ibody-targeted plasminogen activator in vitro

  WAN Hai-Ying LIU Zheng-Hui GU Jing-Ming

  (Jiangsu Institute of Hematology,the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006)

  Abstract Objective:To compare the thrombolytic propertie s in vitro between urokinase(uPA) and the recombinant chimeric plasminogen activ a tor SZ51Hu-scuPA,which was composed of a humanized monoclonal antibody SZ51(SZ5 1 Hu) specifically against activated human platelet and a single-chain urokinase( scuPA).Methods:The fusion protein SZ51Hu-scuPA was produc ed from the supernatant of a stable myeloma cell line growing in spinner flask,a nd then purified by chromatography on a GAH IgG-Sepharose 4B affinity column.Th e binding capacity to activted human platelet of purified fusion protein SZ51Hu -scuPA was obtained by antibody competitive binding assay.The thrombolytic acti vity was determined by lysis of 125I-fibrin-labelled human plasma cl ots.Results:SZ51Hu-scuPA affinity was 67% of the SZ-51M an d the fibrinolytic activity was 39 000 U/mg. The lysis of the clots by SZ51Hu-s c uPA was 4.1~8.4 fold more potent than uPA.Conclusion:Th e fusion protein SZ51Hu-scuPA was more competent to dissolve platelet clots than uPA and it was a new recombinant antibody-targeted plasminogen activator in vit ro.

  Key words Activated platelets  Monoclonal antibody Si ngle-chain urokinase Gene expression Targeting thrombolysis

  抗人活化血小板GMP-140單抗SZ-51(SZ-51M),經放射性核素99mTc標記后(99mTc-SZ51)不僅在實驗性狗股動、靜脈血栓模型中,而且在人 體內血栓顯像中都顯示了良好的顯像效果[1],證明了其血栓導向能力 。與尿激酶的化學偶聯產物體外溶栓率較單用尿激酶提高了3~5倍[2]。本研究對通過基因工程方法獲得的分泌重組SZ51Hu-scuPA抗體導向溶栓劑[3]的陽性細胞克隆進行了體 外擴大培養,應用親和層析技術純化SZ51Hu-scuPA融合蛋白,與uPA對125I標記纖維 蛋白原的不同血小板血栓凝塊在體外進行了溶栓比較,以期得到一種新型的基因工程抗體導 向溶栓劑。

  1 材料與方法

  1.1 實驗材料 人尿激酶純品由南京大學制藥廠朱長生教授惠贈,比活為155000 U/mg;人纖維蛋白原購自Sigma公司;重組SZ51Hu-scuPA的SP2/0細胞株由本室保存。

  1.2 實驗方法

  1.2.1 細胞擴大培養 最初接種采用集合多個小方瓶培養的細胞,棄上清 ,以1×105 ml-1細胞密度接種于轉瓶(500 ml玻璃轉瓶及攪拌動力系統為Bellco公 司產品), 再次接種時可從生長細胞的轉瓶內直接取細胞進行接種。培養基為RPMI1640,補加葡萄糖至 4.5 g/L,置CO2培養箱,37 ℃培養,調節轉瓶內轉子旋轉速度為20 r/min,待細胞停止生長后,繼續培養12~24 h,離心收集上清,-70 ℃儲存備用。

  1.2.2 親和層析純化SZ51Hu-scuPA 應用GAH IgG-Sepharose 4B親和層 析柱純化SZ51Hu-scuPA重組融合蛋白。SZ51Hu-scuPA融合蛋白中相關IgG和相關scuPA抗原 定量采用ELISA或RIA法,scuPA酶活性單位定量采用纖維蛋白平板法[4]。

  1.2.3 鼠源性單抗SZ-51(SZ-51M)和纖維蛋白原的125I標記 采用 Iodogen法[5]標記蛋白。經20%三氯醋酸沉淀法測得標記率為96%~98%。纖維蛋 白原標記125I(125I-Fg)后的可凝蛋白百分比測定,取5 μl 125  I-Fg ,加入0.5 ml人血漿,再加入過量凝血酶,37 ℃放置30 min,離心棄上清,測定凝塊的放 射性計數。由凝塊的放射性計數/加入125I-Fg總放射性計數×100% 計算得可凝蛋白百分比為96%。

  1.2.4 SZ-51Hu-scuPA與SZ-51M的抗體競爭結合試驗 于經凝血酶活化 的 血小板中加入等體積0.25%戊二醛,室溫下固定1 h,0.3% BSA-PBS重懸,計數血小板 。取5× 107血小板加入125I-SZ51M(5×104 cmp,0.65 μg/ml)和不同濃度(20.8 μg/ml 倍比稀釋)的未標記SZ-51Hu-scuPA純品,陰性對照為SZ-2(抗血小板GPIb單抗),總體積1 00 μl,37 ℃反應2 h,用0.01 mol/L,pH7.4的PBS緩沖液洗滌兩次,測定血小板沉淀物的 放射性計數,計算結合率。

  1.2.5 不同濃度血小板血漿凝塊的血栓制備 取健康供血者新鮮全血(3.8% 枸櫞酸三鈉1∶9抗凝),分離PRP血漿(2.5×105血小板/μl);PPP血漿(1×104 血小板 /μl) ;再富集PRP血漿(R-PRP:12×105 血小板/μl)。分別向PRP、PPP和R-PRP血 漿中按下 列順序加入125I-Fg(終濃度500 000 cpm/ml),CaCl2(終濃度0.05 mol /L),凝血酶(終濃度1 U/ml),混勻后立即吸入內徑3.5 mm的硅膠管內,37 ℃靜置30 mi n,將含有凝塊的硅膠管切成1.5 cm長的小段(約含0.12 ml血漿),取出不同血小板濃度的血 栓凝塊(分別稱為PPP、PRP、R-PRP血栓),用0.9% NaCl 3 ml洗滌2次,棄上清后對血栓做 總放射性計數,于每只栓子中加入1 ml PPP血漿。

  1.2.6 體外溶栓 取上述制備的含有PRP、PPP和R-PRP3種血栓的血漿, 再分成4組:生理鹽水組、尿激酶組、尿激酶與SZ51M等摩爾混合組(uPA+SZ51M)以及SZ51Hu -scuPA融合蛋白組。每組分別加入終濃度10、20和50 U/ml酶活性單位的溶栓劑1 ml, 設3個平行管進行溶栓試驗。置37 ℃溫箱溶栓1、2、4和24 h,各點分別取出100 μl上 清做放射性計數。溶栓率=血漿中放射性計數/溶栓前栓子的總放射性計數×100% 。

  1.2.7 纖維蛋白原濃度測定 按Kit說明書進行(纖維蛋白原測定Kit為Stag o公司產品)。

  2 結果

  2.1 SZ51Hu-scuPA的純化 采用GAH IgG-Sepharose 4B 親和層析方法對 收集的轉瓶1 L上清進行純化得純品3 mg左右。酶活性為39 000 U/mg總蛋白。

  2.2 SZ51Hu-scuPA與SZ-51的競爭結合試驗 125I標記SZ-51M與 未標記的融合蛋白SZ51Hu-scuPA與活化血小板保溫后,融合蛋白顯示出和SZ-51M有 競爭結合活化血小板的劑量依賴性效應 (圖1)?!‘?25I-SZ-51M與血小板的結合率下 降了一半,即被加入的融合蛋白抑制了50%,此時融合蛋白IgG的加入量為0.98 μg/ml,而 125 I-SZ-51M為0.65 μg/ml。

  圖1  125I標記鼠源性單抗SZ51與未標記融合蛋白

  SZ51Hu-scuPA之間競爭結合人活化血小板

  Fig.1 Competitive binding between 125I-mouse SZ51 and

  nonl abelled fusion protein SZ51Hu-scuPA towards human activated platelets

  2.3 體外溶栓效率 為了比較融合蛋白的溶栓效率,我們以不同濃度的血小板制備血栓,在10、20和50 U/ml 3種溶栓劑量(陰性對照組為生理鹽水,陽性對照組為u PA和uPA+SZ51M)下,測定不同時間(1、2、4和24 h)的溶栓效率。表1列出了3種濃度血小 板的血栓(PPP:1×104血小板/μl;PRP:2.5×105血小板/μl及R-PRP:12×105血 小板/μl)在不同劑量、不同時間的溶栓結果。顯示在PPP組除陰性對照組無變化外, 陽性對照組在溶栓4 h后,溶栓效率呈增高趨勢,而SZ51Hu-scuPA在所有劑量下 溶栓1 h即產生較高的溶栓效率,2 h比相同劑量的陽性對照組的溶栓率高7.2倍,4 h已接近 完全溶栓。PRP中陽性對照組只在4 h才顯示出溶栓,其它時間的所有劑量組的溶栓率均在 10%左右。然而SZ51Hu-scuPA 10 U/ml時,溶栓4 h后,溶栓率在21%;20 U/ml時,2 、4 h溶栓率分別達17.1%及39.3%;而50 U/ml時溶栓率在1 h就已達44.1%,24 h各劑量組 的溶栓率均達完全。在R-PRP組的溶栓情況與PRP組基本一致,只是在高劑量組( 50 U/ml)時的溶栓率略低于PRP組。另外,在各溶栓劑量組的溶栓過程中,纖維蛋白原的濃 度均未發生改變[(2.5±0.2) g/L],只有劑量為50 U/ml、溶解PPP血漿凝塊時略有降低(0 .96 g/L)。

  表1 重組抗體導向溶栓劑SZ51-scuPA與 uPA、uPA+SZ51M及

  生理鹽水體外溶解125I標記的人血漿凝塊的特征

  Tab.1 Thrombolytic properties of SZ51-scuPA,uPA,uPA+SZ5 1M

  and saline towards 125I-labelled human plasma clots immersed in human plasma in vitro

  Time(h)124241242412424

  Plasminogen activatorPPP(Fibrinogen g/L)PRP(Fibrinogen g/L)R-PRP

  Clot lysis(%)

  0.9%NCl3.55.64.9(2.7)4.63.93. 43.9(2.7)4.62.93.04.21.2

  10 U/ml

  uPA10.912.914.5(2.3)45.310.211.910.0(2.7)55.85.02.95.725.0

  uPA+SZ51M7.214.312.0(2.6)42.112.512.610.0(2.7)49. 23.24.26.022.2

  SZ51Hu-scuPA37.555.165.9(2.2)100.07.410.121.0(2.7)100.06.611.920.4100.0

  20 U/ml

  uPA12.712.916.1(2.3)55.012.212.012.2(2.7)61.61 .74.24.832.1

  uPA+SZ51M11.011.617.8(2.5)55.211.513.111.9(2.6)55.22.02.65.530.0

  SZ51Hu-scuPA56.560.977.8(2.2)10010.017.139.3(2.6)100.0[ ]12.119.740.3100.0

  50 U/ml

  uPA10.011.623.1(2.2)78.510.612.612.7(2.6)77.53.0 4.96.628.0

  uPA+SZ51M8.912.129.0(2.8)83.08.010.111.5(2.6)[ ]73.22.34.37.835.0

  SZ51Hu-scuPA61.883.993.4(1.0)100.044.150.046.9(2.6)100.018.531.141.9100.0

  Note:The results in the table were the mean value from 3 experiments( ±s).The area of s was ±1.0~1.4(lysis of the clots was<10%);±1.5~2.5(lysis of th e clots was 11.0%~14.5%);±4.6~7.6(lysis of the clots was 16.1%~36.0%);±8.1 ~15.2(lysis of the clots was>39.3%)3 討論

  我們通過轉瓶擴大培養、親和層析獲得了SZ51Hu-scuPA 純品,基本上保留了原親本抗體的 親和力(是鼠源性單抗SZ-51M的67%),酶活性為39 000 U/mg總蛋白。在溶解3組含不同 血 小板濃度的人血漿凝塊時,SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓效率明顯高于單用uPA的組的溶栓 效 率,最高分別達7.4倍(PPP血漿凝塊)、4.1倍(PRP血漿凝塊)和8.4倍(R-PRP血漿凝 塊)。隨 著血栓中血小板濃度的增高,盡管SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓效率有所下降,但uPA組下 降更為明顯,尤其在溶解R-PRP血栓凝塊時,uPA組最高劑量點(50 U/ml)在4 h仍未觀 察到溶栓跡象,溶栓率與生理鹽水組相似,而相同劑量SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓率此 時已達41.9%。uPA與SZ51M等摩爾混合組的溶栓結果與uPA組無明顯差異。這些結果表明 ,由 于SZ51Hu-scuPA嵌合分子中抗活化血小板單抗SZ51導向血栓的作用,嵌合分子可明顯提高 溶栓效率,同時證實活化血小板確實是影響溶栓效率的重要因素。

  在制備血栓凝塊時,我們注意到PPP形成的血栓凝塊很疏松,而以R-PRP形成的血栓凝塊則 非常緊密,這就導致溶栓劑在溶解PPP血栓凝塊比PRP、特別是R-PRP血栓時易于滲入到血栓 組織內部,因此不難理解uPA與SZ51Hu-scuPA嵌合分子溶栓效率較PRP及PPP組都出現下降趨 勢。在溶解含高濃度血小板的R-PRP血栓時,由于致密的血栓凝塊影響了溶栓劑進入血栓組 織內部的速度導致溶解血栓的過程只能是從外向內逐步進行。但無論哪一血栓組中,融合蛋 白的溶栓率均比陽性對照組高、溶栓速度快。

  纖維蛋白原濃度測定表明,SZ51Hu-scuPA嵌合分子在提高溶栓效率的同時,基本沒有出現 纖維蛋白原過度降解致濃度下降的情況。至于在SZ51Hu-scuPA嵌合分子應用劑量達50 U/m l,溶解PPP血漿凝塊時出現的纖維蛋白原濃度降低至0.96 g/L的情況,可能與在該劑量時溶栓速度快、效率高有關。從表中可知,早在溶栓的第1 小時溶栓率 已達61.8%,第 2小時83.9%,而我們檢測纖維蛋白原濃度是在溶栓開始后4 h,血栓溶 解后釋放至血漿中被激活的纖溶酶在此之前已開始降解纖維蛋白原,導致濃度下降的緣故。 由于本研究中,比較溶栓效率時采用的活性單位較低,在溶栓4 h檢測纖維蛋白原濃度時uPA 各劑量點尚不足以大量地激活纖溶酶,因此除了產生較低的溶栓率外,也未引起纖維蛋白原 濃度的下降。本研究將為抗體導向溶栓劑的進一步臨床研究提供了可靠的實驗依據。

  本課題由國家“863”高技術科學發展計劃(102-09-03-02)資金資助

  作者簡介:萬海英,女,45歲,主任技師,血液學、生物學博士,主要從事血栓與止 血研究;

  阮長耿,男,60歲,院士,教授,博士生導師,主要從事血液學、血栓與止血研究

  作者單位:李佩霞(蘇州醫學院 附屬第一醫院江蘇省血液研究所血栓與止血研究室,蘇州 215006)

  阮長耿(蘇州醫學院 附屬第一醫院江蘇省血液研究所血栓與止血研究室,蘇州 215006)

  4 參考文獻

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  [收稿1999-06-10 修回1999-11


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