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溶栓活性體外檢測方法概況
發布時間:2017-06-09 ????文章來源:www.rjsfro.com??????? 點擊次數:417

  溶栓活性體外檢測方法概況

  作者: 趙明,潘映紅,王一丁, 中國藥事 摘要撰寫人 TsingHua

  心血管系統疾病是人類最為常見的一類疾病,已成為當今世界人口的第一大死因,而由心血管疾病引 發的血栓并發癥,是造成死亡或病殘的主要原因之一。對于栓塞類疾病,溶栓藥物治療已成為首選 的常規治療方法。當前臨床所用的溶栓藥物大多為第1、第2代產品,如尿激酶、鏈激酶和重組組 織型纖溶酶原激活劑等,它們存在易出血、初始再灌注遲延和失敗、再梗塞、半衰期較短、成本高 、無法口服等缺點。第3代溶栓藥物研究主要集中在3個方面:一是努力尋找更優良的天然溶栓活 性物質;二是對原有天然溶栓物質的改造;三是原有溶栓藥物與另一成分形成的各種嵌合體<1> 。尋找來源豐富、選擇性更強和可以口服的溶栓活性物質已經成為國內外醫學和生物科學的研究熱 點之一。迄今為止,已從蛇毒、蚯蚓,某些昆蟲如螳螂、搔擾角蠅、舌蠅,某些微生物如芽孢桿菌 、鏈霉菌、根霉、米曲霉,某些海洋生物如海藻、正鰹等中發現有溶栓活性的酶<2~12>。溶栓活性體外檢測是發現和評價溶栓藥物的關鍵技術,主要有纖維蛋白平板法(fibrinplateassay,FPA)、發色底物法(chromogenicsubstrate method)、酶聯纖維蛋白溶解法(enzyme linked-fibrinolytic assay,ELFA)、凝塊溶解時間法(clot lysis time assay)、BAEE底物法和酶聯免疫吸附法(ELISA)等。溶栓活性體外檢測方法大量用于科學研究、溶栓藥物質量控制、臨床檢驗及標準檢測中。本文對各種溶栓活性體外檢測方法進行了綜述比較,為改進溶栓活性體外檢測方法和快速、靈敏篩選新溶栓藥物提供參考。1方法概述1 ·1纖維蛋白平板法1·1·1一般纖維蛋白平板法纖維蛋白平板法由Astrup<13>、建立,是將纖維蛋白原、凝血酶和瓊脂制成半透明狀的平板,打孔加樣,37℃孵育,激酶激活纖溶 酶原形成纖溶酶,纖溶酶降解纖維蛋白在平板上形成透明圈,透明圈的大小與酶活力有一定關系。 以標準品酶活力的對數與其所形成透明圈的兩垂直直徑乘積(mm2)的對數為橫、縱坐標,制作 標準曲線,將樣品所形成透明圈的直徑乘積代入即得活力<9,14,15>。也有研究者用透明 圈的兩垂直直徑乘積與所加樣品體積之比(mm2·ml-1)表示酶活力<16,17>;閻家 麒等<18>以標準品酶活力和透明圈面積為橫、縱坐標作圖;鄭鈴等<19>測定組織纖溶酶原 激活物活力時,用透明圈直徑與標準尿激酶活力的對數作圖。由于市售的纖維蛋白原中含有少量的纖溶酶原,因此普通纖維蛋白平板可檢測出纖溶酶活性和激酶活性,一般用加熱平板來分辨這兩種活性。85℃,30min滅活纖維蛋白原中的纖溶酶原后,制備加熱平板;或者將制備好的平板 85℃加熱30min,檢測可直接溶解纖維蛋白的纖溶酶活性。在研究蚯蚓纖溶酶的溶栓機理時 ,遲玉杰等<17>用市售的纖維蛋白原制備普通的纖維蛋白平板,用皂土吸附掉其中的纖溶酶原后,制備無纖溶酶原的纖維蛋白平板。在發現新的溶栓活性蛋白,無標準品檢測活性時,通常用尿 激酶或組織纖溶酶原激活物做標準品,用纖維蛋白平板法測定相對酶活。如郝蘇麗等<20>建議 用組織纖溶酶原激活物-纖維蛋白平板法測定蚓激酶的效價;李群<14>比較了尿激酶-纖維蛋白平板法和組織纖溶酶原激活物-纖維蛋白平板法測定市售蚓激酶的效價,也建議用后者測定蚓激酶效價。1·1·2改良的纖維蛋白平板法纖維蛋白平板法存在費時、成本高和很難標準化等缺點 ,因此在實際應用中很多研究者對該法作了一定的改良。為提高靈敏度以檢測革蘭氏陰性菌的組織纖溶酶原激活物活性,鄭鈴等<19>直接將纖維蛋白原、纖溶酶原和凝血酶室溫下混勻制成不含瓊脂的纖維蛋白平板,其靈敏度比加入瓊脂的纖維蛋白平板提高約500倍。并且在對照平板中加入纖溶酶抑制劑氨基己酸(EACA),抑制纖溶酶活性,觀察是否有其他蛋白酶降解纖維蛋白形成透明圈。但當對照平板和無EACA的平板都有透明圈時,此方法則不能判定究竟是其他蛋白酶單獨作用形成透明圈,還是與組織纖溶酶原激活物共同作用形成透明圈。陳志文等<21>也用無瓊脂的纖維蛋白平板測定枯草芽孢桿菌產生的纖溶酶活性。劉士輝等<22>采用的SDS-PA GE纖維蛋白自顯影是SDS-PAGE電泳與纖維蛋白平板的結合,將有纖溶酶原激活物的樣品 與無還原劑的電泳樣品緩沖液,30℃溫育l~2h后,進行SDS-PAGE電泳,電泳后取下凝膠在2·5%的TritonX-100中輕輕蕩洗lh,然后在凝膠上鋪制一層纖維蛋白瓊脂 糖凝膠,37℃濕盒中放置數小時,隨時觀察溶帶出現情況。比較溶帶位置與分子量標準品位置即可知樣品中活性物的分子量。文獻<23>所稱用來分析血漿中纖溶酶原激活物的存在形式。文獻 <24>中測定納豆激酶活性的血清板法也是纖維蛋白平板法的改進。將血清制成微型纖維平板, 然后在每個孔內加入不同濃度的納豆激酶,反應開始4h以內,每30min測定一次OD655 ,纖維形成初始,在655nm處的吸光度最大;隨著酶的加入,纖維不斷溶解,從而使吸光度下降,吸光度的下降與溶栓酶的濃度成線性關系。此法操作簡便快捷,樣品消耗小,成本低,可信度 高,可同時測定多個樣品,且4h內即可完成。Jones等<23>在96孔微量平板中,加入凝血酶、樣品或標準品、纖溶酶原及纖維蛋白原,制備微量纖維蛋白凝塊,然后在340nm或4 05nm處,用自動分析儀測定各時限的凝塊溶解率,以此來反映纖溶酶原激活物的活性。這一改 進后的方法,使測定更快速,重復性較好,而且容易標準化。Johannes等<25>制備適 當的微量纖維蛋白凝膠后,將血漿標本加在凝膠面上部,用405nm波長記錄凝膠的吸光度值, 經25℃孵育17h后,重新測定405nm吸光度值。根據吸光度的減少與血漿纖溶酶原激活物 的量的相關性,測定樣品激活物的活性。彭勇等<26>從豆豉中篩選溶栓酶時,設計以血粉為主 要基質的富集培養基,以纖維蛋白為主要基質的初篩平板,然后選擇透明圈大的菌株,搖瓶發酵后 用標準的纖維蛋白平板準確測定纖溶活性進行復篩。楊艷燕等<16>篩選產納豆激酶的納豆桿菌時,在纖維蛋白平板中加入25%的LB培養基,作為初篩平板。經過改良后的纖維蛋白平板既能 使菌生長,又可檢測溶栓活性,在菌種篩選中節省了工作量。張守峰等<27>測定組織纖溶酶原 激活物活力時,加入纖溶酶原使靈敏度提高了30倍,最低可檢測出0·01ng(約0·001 IU)的組織纖溶酶原激活物。纖維蛋白平板中,透明圈的形成主要受保溫時間、溫度、平板厚度和纖維蛋白原濃度等影響。保溫時間對測定結果影響最大,張守峰等<27>確定最適保溫時間為18~24h;遲玉杰等<17>研究蚓激酶纖溶活性保溫4h;楊艷燕等<16>篩選納豆桿菌每隔1h觀察一次。溫度一般是37℃,但LiangJF<28>在測定連接了帶正電荷的小肽<(Arg)7Cys>的組織纖溶酶原激活物活性時, 溫度是30℃。Johannes等<25>用微量纖維蛋白平板測定血漿樣品時,溫度是25℃ 。平板厚度沒有統一規定,張守峰等<27>研究發現平板厚度增加,透明圈直徑略有減小,透明 圈出現時間延長,但并不影響透明圈大小梯度及標準曲線形成。纖維蛋白原濃度也無明確規定,一 般為1mg·ml-1,張守峰等<27>用0·5、1·0、2·0mg·ml-1纖維蛋白原分別制板,研究發現纖維蛋白原含量對透明圈形成速度和梯度無明顯影響。但纖維蛋白含量高,形 成的透明圈界限清晰便于觀察測量。纖維蛋白平板法具有簡便直觀,可定性、定量測定,其靈敏度 滿足大多數實驗要求等優點,但是因為影響因素眾多很難標準化,普通的纖維蛋白平板還存在消耗 試劑多、成本高、通量低、時間長等缺陷。改良的方法一定程度上彌補了這些缺點。1·2發色底物法發色底物(chromogenicsubstrate)是一類與對硝基苯胺(pNA)相連的短肽,如S-2251(H-D-Va l-Leu-Lys-pNA)。纖溶酶水解發色底物,生成在405nm有強吸收呈黃色的對硝基苯胺,纖溶酶活性與405nm的吸收值成正比,因此可用發色底物直接測定纖溶酶活性,也可 間接測定纖溶酶原激活物的活性<29>。Friberger<30>最早用S-2251為底 物測定纖溶酶和纖溶酶原的活性?;静僮魇窃诘孜锶芤褐屑尤胗谢钚缘臉悠?37℃水浴1mi n;測定單位時間內410nm光吸收值的變化,并用以下4個公式計算活性?;钚?U/ml) =1·19×ΔA/min活性(U/ml)=0·413×A活性(nkat/ml)=19· 8×ΔA/min活性(nkat/ml)=6·88×A研究者<31>用Sue-A1a-A 1a-Pro-Phe-PNA測定納豆激酶的活性時,定義1min水解底物生成1μl硝基苯胺的酶量為1單位酶活。胡顯文等<32>先用S-2444測定具有催化活性的雙鏈尿激酶活性 ,然后用嗜熱菌蛋白激酶激活無催化活性的單鏈尿激酶為雙鏈尿激酶,用S-2444測定尿激酶 總活性,從而測定單鏈尿激酶的比例。發色底物法十分靈敏,可檢測出低于1×10-11mol 的纖溶酶<30>,因此常用于臨床檢驗和藥物代謝研究。孫東風等<29>用S-2390(D -Val-Phe-Lys-pNA)在酶標儀上測定血漿纖溶酶原的活性,并將其用于臨床檢驗。杜珍香等<33>測定蚯蚓纖溶酶對犬纖溶酶活性影響時,經口給藥后抽血,用S-2251測 定血液纖溶酶活力變化。由于不同酶對不同底物的酰胺水解活力不同,如H·Sumi等<34> 得到的納豆激酶最敏感的底物是S-2251,其次是S-2238、S-2266和S-230 2,對尿激酶底物S-2444和彈性蛋白酶底物S-2484沒有作用,發色底物法存在過分專一的問題,而且價格昂貴,一般都需進口,因此限制了該方法的應用。


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